El creixement dels organismes pluricel·lulars no seria possible si no es produís la divisió cel·lular. La mitosi és el procés general de divisió cel·lular (més concretament del nucli) que assegura el repartiment del material cromosòmic (genètic) a les cèl·lules filles. El nucli cel·lular experimenta un seguit de canvis en un procés continu que, per facilitar el seu estudi, separem en fases:
- Profase: l’embolcall nuclear desapareix i es produeix la condensació dels cromosomes els quals comencen a ser visibles al microscopi.
- Metafase: els cromosomes se situen a l’equador de la cèl·lula formant la placa equatorial.
- Anafase: separació de les cromàtides germanes cap a pols oposats.
- Telofase: descondensació dels cromosomes i formació d’un nou embolcall nuclear.
Després de la divisió del nucli (mitosi) es produeix la divisió del citoplasma, procés que rep el nom de citocinesi.
Fonament teòric
Per observar els cromosomes s’utilitzarà orceïna A, la qual reblaneix les parets cel·lulars i atura la divisió cel·lular i orceïna B que completa la tinció. El colorant té afinitat per les càrregues negatives presents al grup fosfat de la molècula d’ADN, motiu pel qual els cromosomes són tenyits de color morat.
Objectius
- Aplicar tècniques de tinció del material genètic.
- Familiaritzar-se amb l’ús i manipulació del microscopi òptic.
- Observar i identificar cromosomes.
- Identificar les diferents fases de la mitosi en cèl·lules meristemàtiques d’arrel de ceba.
- Reconèixer la importància biològica de la mitosi per als éssers vius.
Material i reactius
- Ceba (Allium cepa)
- Orceïna A i B
- Microscopi òptic
- Portaobjectes i cobreobjectes
- Pinces de dissecció
- Pinces de fusta
- Vidre de rellotge
- Tisores o bisturí
- Agulla emmanegada
- Encenedor Bunsen
- Comptagotes o pipeta Pasteur
- Paper de filtre
Procediment
Cinc dies abans de la realització de la pràctica, es posarà una ceba sobre un vas de precipitats amb aigua de tal manera que la part inferior del bulb estigui en contacte amb l’aigua (fig. 1). En el transcurs dels dies posteriors es podrà observar la formació i creixement de les arrels, les quals poden arribar a mesurar fins a 5 cm de longitud.
- Afegeix sobre un vidre de rellotge unes gotes d’orceïna A.
- Talla a 5 mm de l’extrem una de les arrels. Ajudant-te d’una agulla emmanegada retira les cèl·lules protectores de l’extrem (còfia o caliptra). A continuació col·loca l’arrel en el vidre de rellotge que conté l’orceïna A.
- Encalenteix lleugerament el vidre de rellotge utilitzant un encenedor Bunsen i unes pinces de fusta. Quan el líquid comenci a emetre vapors, retira’l de la flama. Repeteix aquesta operació dues o tres vegades fins que l’arrel agafi un color vinós (fig. 2).
En cas de no disposar d’un encenedor Bunsen, es pot utilitzar una placa calefactora per encalentir la mostra.
❗️ Important
Intenta evitar la formació de bombolles (ebullició) així com que el líquid de la mostra s’assequi.
⚠️ Precaució
Evita inhalar els vapors que es desprenen, ja que poden irritar les mucoses. Utilitza campana extractora o mascareta.
- Amb unes pinces metàl·liques, posa el fragment d’arrel en un portaobjectes i afegeix a continuació unes gotes d’orceïna B.
- Situa el cobreobjectes al damunt i colpeja suaument el punt a on es troba l’arrel amb el mànec de l’agulla emmanegada o un objecte similar (fig. 3). Si s’ha fet correctament, el teixit quedarà aixafat amb les cèl·lules esteses.
- Cobreix la preparació amb un tros de paper de filtre doblegat unes quantes vegades, de manera que cobreixi l’àrea del cobreobjectes. Amb el palmell de la mà en posició intermèdia, exerceix pressió progressiva en el centre del cobreobjectes evitant que aquest es desplaci cap als costats. Al mateix temps que augmentes la pressió, realitza un moviment oscil·latori amb el canell (fig. 4). Aquesta forma d’estendre la mostra sobre el portaobjectes es coneix amb el nom de squash.
- Col·loca la preparació en el microscopi òptic. Comença amb l’objectiu més petit (vermell). Quan hagis localitzat una zona interessant, canvia l’objectiu per un de més augments. Repeteix l’operació les vegades necessàries fins a arribar a trobar cèl·lules en mitosi.
Resultats
A1. Utilitza l’objectiu de més augments per identificar les diferents fases de la mitosi. Obté una imatge de cada fase i relaciona-la amb les figures que es mostren a continuació per completar la taula.
| Fase | Figura | Imatge microscopi | Descripció |
|---|---|---|---|
| Interfase | |||
| Profase | |||
| Metafase | |||
| Anafase | |||
| Telofase | |||
| Citocinesi |
A2. Completa la taula indicant el nombre de cèl·lules que es poden observar en cada fase del cicle cel·lular. Fes-ho de 3 camps diferents utilitzant l’objectiu de 40x.
| Fase | 1r camp | 2n camp | 3r camp | Total |
|---|---|---|---|---|
| Interfase | ||||
| Profase | ||||
| Metafase | ||||
| Anafase | ||||
| Telofase |
A3. Utilitzant les dades de la taula anterior, calcula l’índex mitòtic del teixit (proporció de cèl·lules que es troben en fase mitòtica) aplicant la següent fórmula:
índex mitòtic = nombre de cèl·lules en mitosi ÷ nombre total de cèl·lules
A4. Realitza un gràfic de barres que mostri la proporció de cèl·lules en cada una de les fases.
Discussió i conclusions
A5. Analitza la relació que hi ha entre la freqüència de cèl·lules observades a cada fase i la durada d’aquesta.
A6. En quina fase de la mitosi és més fàcil el recompte i visualització dels cromosomes? Per què?
A7. Un grup d’investigadors ha determinat que l’índex mitòtic del teixit meristemàtic d’arrel de ceba és 0,24. Compara’l amb els teus resultats donant arguments de per què hi ha aquestes possibles diferències.
Qüestions
A8. Explica per què per observar cèl·lules en mitosi en vegetals s’utilitzen cèl·lules de la zona terminal de les arrels. En quins altres teixits vegetals es podrien observar cèl·lules en mitosi?
A9. Es poden observar els cromosomes quan la cèl·lula no està en divisió? Per què?
A10. Sobre el procediment, per què s’encalenteix la mostra? Quina és la funció de la tècnica squash?