L’any 1978 s’aconsegueix una de les fites més importants en el camp de la biotecnologia i l’enginyeria genètica: la síntesi d’insulina idèntica a la humana per bacteris recombinants.
El procediment va ser molt enginyós, utilitzant bacteris de Escherichia coli com fàbriques en miniatura per produir la insulina humana, introduint el gen que la codifica mitjançant un vector de clonació.
El resultat va ser una insulina humana més barata de produir, més potent i més segura, ja que no mostrava els principals problemes de les seves homòlogues animals utilitzades fins aquell moment.
La seva distribució començà a principis dels anys 80 com a tractament de la diabetis, essent la primera proteïna recombinant aprovada pel seu ús com a medicament. Actualment, tota la insulina que es comercialitza ha estat produïda per bacteris recombinants.
T’animes a crear ADN recombinant?
Objectius
Dissenyar i elaborar un plasmidi recombinant amb el gen de la insulina humana. Per fer-ho, hauràs de:
- Determinar quin enzim de restricció és el més adequat per obtenir ADN recombinant.
- Determinar quin antibiòtic s’ha d’utilitzar en el medi de cultiu per seleccionar els bacteris recombinants.
Material
- Fotocòpies del plasmidi, l’ADN nuclear i els enzims de restricció (preferiblement en fulls de diferents colors)
- Full de respostes
- Tisores
- Cinta adhesiva transparent
- Clip
Preparatius de l’activitat
L’activitat es desenvoluparà per parelles. Cada parella entregarà un únic informe en finalitzar l’activitat. Abans de començar, cal preparar el plasmidi, l’ADN i els enzims de restricció.
Plasmidi
- Retalla les 6 tires del plasmidi. Descarta 2 tires a excepció de la que conté l’origen de replicació.
- Mescla i uneix amb cinta adhesiva de forma aleatòria les 4 tires restants. Fixa’t que totes les lletres estiguin orientades en una mateixa direcció.
- Uneix amb cinta els dos extrems del paper per formar un cercle. Aquesta tira de paper representa el plasmidi (ADN circular i tancat).
ADN nuclear
- Retalla les 6 tires amb la seqüència de nucleòtids de la fotocòpia amb l’ADN nuclear.
- Uneix amb cinta transparent les tires en ordre (ajuda’t del número que trobaràs als extrems de cada tira).
Enzims de restricció
- Retalla els 8 enzims de restricció.
Desenvolupament de la tasca
Elaboració del mapa del plasmidi
A1. Marca la posició relativa de tots els gens de resistència a antibiòtics que conté el teu plasmidi. Indica al costat de cada un l’antibiòtic al qual donen resistència.
A2. Assenyala la posició relativa dels talls que poden fer en el plasmidi cada un dels 8 enzims de restricció. Escriu el nom de l’enzim de restricció al costat de cada marca.
Disseny del vector de clonació
Ha arribat el moment de començar a provar els diferents enzims de restricció. El teu treball com a biotecnòleg és trobar un enzim de restricció dels 8 disponibles que talli el plasmidi per un únic lloc. El mateix enzim també ha de ser capaç de tallar l’ADN nuclear en dues posicions (abans i després del gen de la insulina). És convenient que els talls siguin tan propers com sigui possible al gen de la insulina.
A3. Omple la taula indicant per a cada enzim:
- Nombre de talls que realitza al plasmidi.
- Nombre de talls que realitza a l’ADN nuclear.
- Indica si utilitzaràs o no l’enzim de restricció per elaborar el vector de clonació i el motiu d’aquesta decisió.
Edita
| Enzim de restricció | Talls (plasmidi) | Talls (ADN) | Utilitzat (sí/no) | Motiu pel qual has decidit utilitzar o no l’enzim |
|---|---|---|---|---|
| Ava II | 2 | 2 | No | L’enzim de restricció no pot tallar el plasmidi per 2 posicions, ja que es formarien 3 fragments. A més, un dels talls es realitza a on es troba el gen de resistència a la kanamicina, per la qual cosa no es podria utilitzar aquest antibiòtic en el medi de cultiu. |
| Bam HI | ||||
| Bgl II | ||||
| Eco RI | ||||
| Hind III | ||||
| Hpa II | ||||
| Sac I | ||||
| Xma I |
Important
Si no trobes cap enzim de restricció que talli el plasmidi una única vegada, reconstrueix-lo utilitzant els dos fragments que havies descartat.
Elaboració del vector de clonació
Una vegada hagis triat quin és l’enzim més adequat, marca amb llapis els nucleòtids per a on l’enzim de restricció tallarà les seqüències d’ADN. Fixa’t que els extrems que es formen són cohesius. Utilitza les tisores per tallar el plasmidi i el fragment d’ADN que conté el gen de la insulina. A continuació aferra les dues tires amb cinta adhesiva. Enhorabona, has creat el teu ADN recombinant!
A4. Adjunta amb un clip la tira d’ADN recombinant al teu full de respostes.
Selecció del medi de cultiu
Conèixer quins gens de resistència a antibiòtics conté el plasmidi recombinant és essencial, ja que d’aquesta forma podem seleccionar els bacteris que l’han incorporat al seu citoplasma.
A5. Determina quins antibiòtics es poden utilitzar en el medi de cultiu i quins no per comprovar que el plasmidi s’ha transferit correctament. Justifica la teva decisió.
Edita
| Antibiòtic | Utilitzat (sí/no) | Justificació |
|---|---|---|
| Ampicil·lina | No | No es troba present en el plasmidi recombinant. |
| Tetraciclina | ||
| Kanamicia |
Aplicacions de la tecnologia de l’ADN recombinant
A6. Comenta altres aplicacions que pot tenir la tecnologia de l’ADN recombinant, així com algunes de les seves implicacions ètiques i socials.